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| 狂犬病快速诊断方法的建立和应用 |
| xumu.com.cn 2004-11-16 |
摘要：根据狂犬病病毒核蛋白基因序列设计了1对引物，利用RT-PCR技术从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及乳鼠脑组织中，扩增出443bp的核酸片段，敏感性约为 3pg。对36份不同种动物脑组织的检测结果与传统方法荧光抗体试验（FAT）和小鼠脑内接种试验（MIT）的测定结果完全吻合，但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断，具有快速、简便、和敏感的特点。 关键词：狂犬病病毒；RT-PCR；检测 中图分类号： 文献标识码： 文章编号：1671-7236（2005） 狂犬病是由狂犬病病毒感染中枢神经系统而引起的一种人畜共患传染病。狂犬病病毒（Rabies virus）为弹状病毒科（Rhaboviridae）,狂犬病毒属（Lyssaavirus）成员，其基因组为单股负链RNA，编码N、P、M、G、L等5种结构蛋白。核蛋白（N）基因高度保守又高效表达，可以用于狂犬病病毒感染的诊断和调查。本研究根据N基因的保守性设计了1对引物，对狂犬病病毒不同毒株进行了RT-PCR检测，并对不同种动物脑组织进行了RT-PCR检测，旨在为及时诊断狂犬病提供一种可靠、快速、准确的监测手段。 1. 材料与方法 1.1 材料 1. 1.1 毒株和细胞株 CVS、8202和SRV9毒株由本室保存，BHK-21细胞由本室保存。 1. 1. 2 试验样本 36份脑组织（犬脑12份、鼠脑10份、牛脑8份、鹿脑4份、马脑2份）均为FAT和MIT阳性，由各地收集本室保存。 1. 1. 3 主要试剂 RNA提取试剂、RT-PCR试剂均购自TaKaRa 公司 1. 1. 4 主要仪器 PCR仪（军事医学科学院放射研究所）、电泳仪（北京六一仪器厂）、高速台式冷冻离心机（Sigma）、CO2培养箱（SANYO）、凝胶自动成像系统（UVI） 1.2 病毒培养 以含10%犊牛血清的MEM营养液，按常规量加入双抗、谷氨酰胺和NaHCO3，待BHK21细胞长成单层后，以含2%血清MEM营养液换液，同时按2%分别接入CVS株、8202株和SRV9株狂犬病病毒，置33℃培养72—96h收获病毒[1-3]。 分将20ul CVS株、8202株和SRV9株狂犬病病毒脑内接种3日龄乳鼠，待4-5天濒死期采取鼠脑。 1.3 引物的设计与合成 根据N基因序列[4-6]设计了1对引物N1、N2，由上海生物工程公司合成。引物序列如下： N1：（587）5’-TTT GAG ACT GCT CCT TTT G-3’(605) N2：(1029) 5’-CC CAT ATA GCA TCC TAC-3’(1013) 1.4 RNA 的提取 病毒细胞培养物和鼠脑组织按TRIZOL一步法[7]提取。 1.5 RT-PCR 取10╳ One Step RNA PCR Buffer 2.5 µL、25 mM MgCl2 5 µL、10 mM dNTP 2.5 µL、Rnase Inhibitor、AMV和AMV-Optimized Taq各 0.5 µL、引物1 µL，制成混合液，加入12.5 µL DEPC水溶解的RNA，混合均匀后50℃ 30 min RT反应，然后放入PCR仪中，执行如下程序：94℃变性120s后，于94℃ 30s、50℃ 90s、72℃ 60s，循环扩增30次，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.6 敏感性试验 将含毒的BHK-21细胞培养物中所提取RNA做10倍系列稀释后，进行RT-PCR扩增，比较其扩增的敏感性。 1.7 重复性试验 将狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的RNA反转录产物以N1/N2分别作3次PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，分析结果。 1.8 应用性试验 取36份不同种动物脑组织，分别为：犬12份、鼠10份、牛8份、鹿4份、马2份，均为FAT和MIT检测阳性。提取RNA，使用引物N1/N2进行RT-PCR检测。 2 结果 2.1 RT-PCR扩增 用设计的引物对狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株核酸进行RT-PCR扩增，结果均得到443 bp的核酸片段，与设计相符，说明其为特异性扩增产物。在相同的反应条件下，对照样品犬腺病毒和犬瘟热病毒及正常细胞培养物和鼠脑组织扩增结果为阴性。（图1略） 2.2 敏感性试验 以N1/N2引物对所提RNA (3.25µg)10-1—10-7稀释后进行RT-PCR，结果最小检出的RNA量为3.25pg。（图2略） 2.3 重复性试验 经在不同时间3次对狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的RNA反转录产物进行PCR扩增，结果一致。 2.4 应用性试验 对36份不同种动物脑组织进行RT-PCR 检测，结果同样只产生1条443 bp 的条带，阴性对照无特异条带，与FAT和MIT检测结果完全吻合。 3 讨论 本研究对3株狂犬病病毒进行了RT-PCR扩增，N1/N2引物对所有毒株都能得到1条与预先设计大小相符的443bp条带，且对非狂犬病病毒及正常细胞培养物和鼠脑组织则未出现任何扩增条带。由此表明，所设计的引物对狂犬病病毒的扩增是特异的。试验中对狂犬病病毒的检测灵敏度可达3pg。因此，RT-PCR 较常规方法更灵敏、特异，可直接用于临床诊断。 研究表明，狂犬病病毒各毒株间的核蛋白（N）有高度保守性，不同株系的核蛋白同源性在98%—99.6%之间，为病毒中最稳定的蛋白[8]。根据核蛋白（N）基因高度保守又高效表达，可以用于狂犬病病毒感染的诊断和调查。本研究以N基因序列设计的N1/N2对狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株培养物以及对36份不同种动物脑组织均能得到443 bp的扩增条带。RT-PCR检出结果与传统试验鉴定结果完全一致。但经典方法在操作上费时、费力，花费昂贵，且不能立即得出确诊的结果。本试验证明了所设计的引物N1/N2能对大多数狂犬病毒株进行检测，方法敏感、特异，结果可靠，且节省了时间，在3h内便可以出结果，不仅可以用于临床确诊，还可用于流行病学分析。 RT-PCR 对内外环境要求严格，外部环境要求尽量净化空气、一次性用品，内部环境要求PCR仪器内反应温度要均一。扩增成功还要求检测时取样准确，一般是取材部位所含病毒量越多越容易准确诊断，本研究针对细胞培养物和脑组织进行了试验，而其他组织中是否能快速、准确的检测到病毒还有待进一步研究。 参 考 文 献 [1]Echevarría J E,et al. J Clin Microbiol. 2001 Oct; 39(10): 3678-3683. [2]Schwab K J,et al. Appl Environ Microbiol. 2001 Feb; 67(2): 742-749. [3] Mikako ITO ,et al. Vet.Med.Sci. 63(12) :1309-1313, 2001. [4]Debora Sacramento,et al. Molecular and Cellular Probes (1991) 5, 229-240. [5] Picard-Meyer E,et al. Vaccine. 2004 May 7;22(15-16):1921-9. [6 David D,et al. Vet Microbiol. 2002 Jun 20;87(2):111-8. [7] J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，黄培堂 等 译[M]. 分子克隆实验指南（第三版）[M].2002，科学出版社. [8] 殷震，刘景华主编. 动物病毒学（第二版）[M]. 1997，科学出版社. The Development and Application of Rapid Diagnosis for Rabies Virus Abstract : We have developed the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification technique of viral nucleic acids as an alternative protocol for diagnosis of rabies and rabies related strains.A primer set mapping in the nucleoptotein cistron allowed a specific and sensitive amplification of infected mouse brain material and tissue-culture supernatant.36 brain samples from different animal species:12 dogs,10 mice,8 cattle,4 deer,2 horse,which were found to be positive by means of the fluorescent antibody test (FAT) and the mouse inoculation test (MIT) were retested with RT-PCR.Compared with FAT and MIT ,RT-PCR was more rapid and efficient to detect rabies virus. Key words : rabies virus , RT-PCR , detection |
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