1　材料与方法

本研究中的血清，分别由山东银香伟业生物工程有限公司、 Gibco 公司生产，并作对照。

1.1 猪卵巢卵母细胞的体外成熟

从屠宰场收取猪卵巢，用 20G注射针从直径2 - 8mm的有腔卵泡中抽取卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte Complex, COC）。 以TCM199+10IU/mL PMSG,hCG+0.57mmol/L 谷氨酰胺+15%FCS和10%猪卵泡液（pFF）为猪卵母细胞体外成熟培养液。COC首先在体外成熟培养液中培养２０～２２h（39℃,５％CO 2 ），随后置于无激素（PMSG,hCG）的上述培养液中继续培养２０～２２h，用透明质酸酶（1 mg/mL），结合微玻璃管反复吹吸，除去卵丘细胞; 剖解方法收集小于2 mm卵泡中的卵母细胞。

1.2 成纤维细胞的准备

从仔猪耳上取一小块组织（ 0.5cm×0.5cm×1.0cm）。在HBSS液中漂洗5次，刮去毛发，进一步剪成小块，在不锈钢网上过滤，37℃,0.25%胰蛋白酶中消化10min，500g离心10min，弃取上清液。沉淀的成纤维细胞转移至25ml细胞培养瓶。培养液用TCM199 penicillin(100 IU/mL) , Streptomycin(100 μg/mL) 和 15% FBS；传代至4 - 8代用作供体细胞，一部分细胞冷冻保存；使用前5天以血清饥饿法（5% FCS）将供体细胞诱导至G0或G1期。实验前数分钟用胰酶分散，得到单个细胞。

1.3 卵丘细胞的准备

将 COC置于含0.1%透明质酸酶的培养液分离卵丘细胞，700g离心5min, 以TCM199清洗数次。随后在35mm培养皿中进行体外培养，培养液用TCM199加 15%FBS；传代至2 - 4代用作供体细胞，一部分细胞冷冻保存；使用前5天以血清饥饿法（5%FCS）将供体细胞诱导至G0或G1期。实验前数分钟用胰酶分散，得到单个细胞。

1.4 去核、融合与激活

将获取的卵母细胞尽快置于含 ( fatty acid-free BSA 3 mg /mL 和 cytochalasin B 5 μ g /mL )的改良TCM199中。以固定管吸住卵母细胞，用尖端去核管直接插入透明带内吸取第一极体及其下方的染色质。去核后卵母细胞置于含 5 μ g /mL Hoechst33342 的 TCM199中，39℃孵育15 - 20min，紫外光下检测去核效果。通过去核时在透明带上留下的孔，将成纤维细胞、卵丘细胞(20 - 25 μm)注入卵周隙中，供核细胞与卵母细胞的接触面与电极丝相平行，细胞融合在含有0.3mol/L甘露醇，0.4mol/LMgSO 4 , 0.5mol/L CaCL 2 和3% BSA的融合液中进行，融合条件为：100 V /mm DC， 30 μs刺激一次[ Electro Cell Manipulator 2001 M (BTX, San Diego, CA, USA)] ，电 刺激后的重构卵在 NCSU-23（加4 mg/ mL BSA）培养液中培养30min，在立体显微镜下观察融合结果。

将重构卵胚置于 10μmol/L 钙离子载体 A23187 (Sigma)的 NCSU-23培养液中培养5min 或1个直流脉冲（125 V /mm， 70 μs），随后置于NCSU-23（含2mmol/L 6-DAMP 和4 mg /mL BSA）加10%胎牛血清，培养液中培养5h，培养条件39℃,５％CO 2 。所有的显微操作都在Leica显微操作系统下进行。

1.5 数据处理

所有的数据均用 X 2 统计进行分析，凡是 p < 0.05 为是差异显著， p < 0.01 为是差异显著。

2 结果

2.1 成纤维细胞重构胚和卵丘细胞重购胚的体外发育

表 1 成纤维细胞重构胚的体外发育

Table2 In vitro development of reconstituted porcine embryos after nuclear transfer using FC